martes, 19 de febrero de 2013

PROTEÍNAS RECEPTORAS

AISLAMIENTO Y CLONACIÓN DE RECEPTORES



En la década de 1970-1980 la farmacología entró en una nueva fase cuando se confirmó por medios bioquímicos la existencia real de los receptores, que hasta ese momento habían sido sólo entidades teóricas, gracias al desarrollo de técnicas para marcar los receptores que permitían extraer y purificar el material radiomarcado. Este método se utilizó con éxito por primera vez con el receptor nicotínico de acetilcolina aprovechando dos circunstancias curiosas. La primera es que los órganos eléctricos de muchos peces, como las rayas (Torpedo) y las anguilas eléctricas (Electrophorus), están formados por tejido muscular modificado en el que abundan una membrana sensible a la acetilcolina y estos órganos contienen receptores de acetilcolina en cantidades muy superiores a las de cualquier otro tejido. En segundo lugar, el veneno de las cobras contiene polipéptidos que se unen con una especificidad muy elevada a los receptores nicotínicos de acetilcolina. Estas sustancias, conocidas como toxinas alfa, pueden marcarse y utilizarse para valorar la cantidad de receptores presente en tejidos y extractos tisulares. La mejor conocida es la alfa-bungarotoxina, que es el principal componente del veneno de la serpiente rayada malaya (Bungarus multicinctus). Al tratar el músculo o el tejido eléctrico con detergentes no iónicos, la proteína receptora unida a la membrana se vuelve soluble y puede purificarse mediante la técnica de cromatografía de afinidad, en la que se emplea un ligando para el receptor, unido covalentemente a la matriz de una columna de cromatografía, para adsorber el receptor y separarlo  de las demás sustancias presentes en el extracto. A continuación, se puede eludir de la columna lavándola con una solución que contenga un antagonista, como gallamina. Actualmente se emplean métodos parecidos para purificar numerosos receptores de hormonas y neurotransmisores, así como canales iónicos, proteínas transportadores y otros tipos de moléculas diana.



Una vez que se logró aislar y purificar las proteínas receptoras, se pudo analizar la secuencia de aminoácidos de un segmento muy corto y deducir la secuencia de bases correspondiente del ARNm. A continuación se sintetizaron sondas de oligonucleótidos y se usaron para extraer la secuencia  completa de ADN mediante métodos convencionales de clonación de ADN complementario (ADNc), comenzando por una biblioteca de ADNc obtenida de un tejido rico en el receptor investigado. Así se obtuvieron los primeros clones de receptores, pero actualmente existen estrategias alternativas para la clonación de expresión, en la que no es necesario aislar y purificar antes la proteína receptora.



Gran parte de la información se ha obtenido introduciendo el ADN clonado que codifica determinados receptores en líneas celulares mediante transfección, con lo que se logran células que expresan los receptores extraños de modo funcional. Estas células de ingeniería genética permiten un control mucho más preciso de los receptores expresados del que se puede conseguir con células naturales o tejidos intactos y la técnica se emplea mucho para estudiar las características farmacológicas y de unión de los receptores clonados.



La clonación de receptores suele revelar la existencia de variantes moleculares (subtipos) de receptores conocidos que no se habían detectado en los estudios farmacológicos. Esto suele producir alguna confusión taxonómica pero, a la larga, la caracterización molecular de los receptores resulta esencial. Barnard, uno de los mayores expertos en la clonación de receptores, no se extraña de la proliferación de subtipos moleculares de receptores que los farmacólogos creían que conocían perfectamente y cita a Santo Tomás de Aquino: "Los tipos y las sombras han llegado a su fin, ya que ha llegado el nuevo rito". El nuevo rito, explica con confianza, es la biología molecular.


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